Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit Instruções de operação
- Tipo
- Instruções de operação
Somente para uso veterinário. Somente para uso in vitro.
INSTRUÇÕES DE USO
PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit
ELISA para a detecção de anticorpos contra o virus da Peste Suína Clássica em soro ou plasma de suínos
Nº de produto 7630100
N.º de pub. MAN0018655 Rev. A.0
PRODUTO IMPORTADO
ATENÇÃO! Leia as Ficha de Informações de Segurança (FISPQ) e siga as instruções de manuseio. Use trajes, óculos e luvas de proteção
adequados. Ficha de Informações de Segurança (FISPQ) estão disponíveis em thermofisher.com/support.
ATENÇÃO! RISCO BIOLÓGICO POTENCIAL.
Leia as informações de segurança sobre risco biológico na página do produto em thermofisher.com.
Use trajes, óculos e luvas de proteção adequados.
Introdução
A Peste Suína Clássica (PSC) também conhecida como cólera suína é uma doença viral contagiosa notificável dos suínos e economicamente importante na
maioria dos países produtores de carne suína. A rápida detecção de um suíno infectado é essencial para prevenir a propagação do vírus e o controle da
doença. O teste padrão “ouro” é a análise de soro neutralização peroxidase-ligada (NPLA), conforme descrito por Holm-Jensen. Contudo, o NPLA é
laborioso, demorado, de difícil padronização e conseqüentemente não adequado para sorologia em massa. Por esta razão, ELISA’s foram desenvolvidos e
descritos (Wensvoort et al e Colijn et al).
Entretanto, a PSC está muito relacionada com pestiviroses que causam diarréia bovina viral e doença de Border. Especialmente em criações de suínos que estão
próximas a rebanhos BVDV ou BD, reações cruzadas de anticorpos contra BVDV ou BD podem causar resultados falso-positivos no ELISA. Para prevenir
reações falso- positivas causadas por reações cruzadas com anticorpos BVDV ou BD, foi desenvolvido um ELISA que detecta especificamente anticorpos contra
o domínio A da proteína E2 da PSC. É sabido que este domínio é mais específico para PSC que o domínio B, C ou D.
O Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit detecta anticorpos contra cepas da PSC de alta, moderada e baixa virulência, nos estágios
iniciais da infecção. Detecção de anticorpos gerados por vírus da PSC de baixa virulência, é de importância fundamental para diagnosticar infecções subclínicas
da PSC. Adicionalmente, a especificidade do PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit é otimizada pela detecção de anticorpos bloqueadores direcionados
contra o domínio A da proteína E2 do vírus da PSC.
O kit de teste contém todos os ingredientes necessários para realizar o teste. Com o kit PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit 450 amostras podem ser
testadas.
Principio do kit
Os reagentes básicos usados no PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit é um anticorpo monoclonal (MAb) dirigido contra um epítopo localizado no
domínio A do envelope da proteína E2 (GP-55) da PSC. O domínio A é escolhido porque este domínio antigênico é mais específico para PSC que o domínio
B, C ou D de E2. O MAb é marcado com peroxidase de raiz forte (HRPO) e usado como conjugado para medir a ligação dos anticorpos da PSC na amostra
teste direcionada contra a proteína E2 da PSC. As placas são revestidas com proteína E2 que é expressa pelo sistema baculovírus.
A amostra teste e o diluente de amostras são adicionados nas cavidades da placa de teste e incubados a 37°C. Na seqüência, as placas são lavadas e o MAb
HRPO é adicionado em todas as cavidades e incubados a 37°C. Em seguida as placas são lavadas e a solução de cromogênio/substrato pronta para uso é
adicionada em todas as cavidades da placa. Após incubação à temperatura ambiente o desenvolvimento de coloração é bloqueado e medido. Se o
conjugado MAb se ligou ao epítopo específico no antígeno da PSC, ocorrerá desenvolvimento de coloração, indicando a ausência de anticorpos específicos
para PSC na amostra. Se o epítopo é bloqueado por anticorpos específicos para PSC na amostra em teste o MAb não pode se ligar ao antígeno. Neste caso
não há desenvolvimento de coloração indicando que anticorpos específicos para PSC estão presentes na amostra em teste.
Três controles de referência prontos para uso estão incluídos no kit: um controle positivo, um positivo fraco e um negativo. O controle negativo é usado para
estabelecer o valor de DO450 máxima. O controle positivo fraco e o positivo devem sempre apresentar porcentagem de inibição de >50%.
Componentes do kit
Kit de 5 placas para 450 muestras. Armazenar a 5±3°C ate a data de
validade.
Componente
Descrição
1: Placas de teste
Cinco placas de teste embalados a vácuo com um
sachê desumidificante.
2: Conjugado
Concentrado 30x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 2.5 mL de conjugado. Após diluído não é
estável, preparar somente no momento de uso.
3: Diluente de conjugado
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
diluente de conjugado.
4: Fluido de lavagem
Concentrado 200x, diluir antes do usar. Um frasco
contendo 60 mL de fluido de lavagem. Prazo de
validade da solução de lavagem: 1 semana a 22±3°C.
5: Diluente da amostra
Pronto para uso. Dios frascos contendo 11.0 mL de
diluente da amostra.
6: Controle positivo
Pronto para uso. Um frasco contendo 2.2 mL de
controle positivo.
7: Controle fraco positivo
Pronto para uso. Um frasco contendo 2.2 mL de
controle fraco positivo.
8: Controle negativo
Pronto para uso. Um frasco contendo 2.2 mL de
controle negativo.
9: Substrato Cromogênio
(TMB)
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
substrato cromogênio (TMB).
10: Solução bloqueadora
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
solução bloqueadora.
Adicionais
10 adesivos para selar as placas
Materiais adicionais necessários não fornecidos
A menos que haja orientações diferentes, todos os materiais estão
disponíveis em thermofisher.com.
• Água dionizada
• Reservatório para solução
• Pipeta monocanal (5–50 µL)
• Vórtex
• Pipeta monocanal (20–200 µL)
• Tubos
• Pipeta monocanal (100–1000 µL)
• Incubadora de microplaca (alcançando
no mínimo 50°C)
• Pipeta multicanal (5–50 µL)
•
(Opcional)
Lavadora de placas Tecan
EIA Tray Washer ou equivalente
• Pipeta multicanal (50–300 µL)
• Leitor de placas Multiscan EX ou
equivalente. O leitor deve possuir um
filtro apropriado para leitura de placas
a 450 nm
• Ponteiras para pipetas (como
recomendado pelo fabricante da pipeta)
Procedimento do teste
Precauções
As regulamentações nacionais de segurança devem ser rigorosamente
seguidas. O PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Plate Kit deve ser usado em
laboratórios apropriados para este tipo de teste.
Para obter resultados ótimos com o PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0
Strip Kit, deve-se considerar o seguinte:
• O protocolo de procedimento de teste deve ser estritamente seguido.
• Todos os reagentes do kit devem estar a temperatura ambiente
(22±3°C) antes do uso.
• A solução bloqueadora é fortemente ácida. Evitar contato com pele e olhos.
• As ponteiras das pipetas devem ser trocados a cada etapa de
pipetagem.
• Utilizar recipientes separados para cada reagente.
• Os componentes do kit não devem ser usados após a data de validade
ou se forem observadas alterações em sua aparência.
• Componentes de diferentes partidas de kits não devem ser misturadas.
• Deve ser usado para o teste água desmineralizada ou de qualidade
semelhante.
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thermofisher.com
21 junho 2019
Soluções de preparo prévio
Conjugado (30x)
Prepare a diluição de trabalho do conjugado (especificada no rótulo do
frasco) em diluente de conjugado (Componente 3).
Para 1 placa, prepare 12 mL de solução (adicione 0.4 mL de conjugado
concentrado (30x) para 11.6 mL de diluente de conjugado).
Obs.:Deve-se preparar a diluição de trabalho somente antes de usa.
Solução de lavado
O fluido de lavagem (200x) (Componente 4) deve ser diluído em água
desmineralizada ou destilada (veja o rótulo do frasco) e é suficiente para
um volume final de 12 litros.
Estabilidade da solução de lavagem: 1 semana armazenada a a 22±3°C.
Obs.: Deve ser usado lavadoras de ELISA comercialmente disponíveis. Se
não for possível, a lavagem da placa pode ser feita dispensando-se
200-300 µL de solução de lavagem em todas as cavidades da placa. Em
seguida, esvaziar e repetir quantas vezes como prescrito. Não é necessário
encharcar a placa entre as lavagens. Bater a placa firmemente após a última
lavagem.
Incubação do soro
1. Adicione 20 µL de diluente de amostra (Componente 5) em todas as
cavidades.
2. Adicione 80 µL do soro controle negative (Componente 8) nas
cavidades A1 e B1.
3. Adicione 80 µL do soro controle positive fraco (Componente 7) nas
cavidades C1 e D1.
4. Adicione 80 µL do soro controle positive (Componente 6) nas cavidades
E1 e F1.
5. Adicione 80 µL da amostra teste em uma (teste simples) ou duas (teste
em duplicata) cavidades adjacentes da placa de teste de tiras.
6. Sele as placas do teste.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube as tiras por 60±5 minutos a 37±1°C.
Incubação com o conjugado
1. Esvaziar a placa de teste após o período de incubação e lavar a placa
6 vezes com 200–300 µL de solução de lavagem. Bater as placas
firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de solução de trabalho do conjugado em todas as
cavidades.
3. Sele as placas do teste.
4. Incube as tiras por 30±1 minutos a 37±1°C.
Incubação com solução substrato cromogênio (TMB)
1. Esvaziar a placa de teste após o período de incubação e lavar a placa
6 vezes com 200–300 µL de solução de lavagem. Bater as placas
firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de solução substrato cromogênio (TMB)
(Componente 9) em todas as cavidades.
3. Incube as placas por 20 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
4. Adicione 100 µL de solução bloqueadora (Componente 10) em todas as
cavidades.
5. Misture o conteúdo de todas as cavidades da placa do teste.
Observação: Inicie a adição da solução bloqueadora 20 minutos após a
primeira cavidade ter sido preenchida com solução de
cromogênio/substrato. Adicione a solução bloqueadora na mesma ordem e
no mesmo ritmo que a solução cromogênio/substrato foi adicionada.
Leitura e cálculo dos resultados
1. Menir a densidade óptica (DO) de todas ascavidades a 450 nm
preferencialmente em um intervalo de 15 minutos após o
desenvolvimento da coloração ter cessado.
2. Calcule o valor DO450 médio do controle negativo (cavidades A1 e B1).
Este é o valor de DO máximo.
3. Calcule a porcentagem de inibição (PI) do controle positivo fraco e
controle positivo e das amostras testes de acordo com a fórmula abaixo.
PI = 100 − (DO450 amostra / DO450 máx) × 100
Observação: A DO450 de todas as amostras é expressa da como porcentagem
de inibição (PI) relativa à DO450 máximo.
Interpretación dos resultados
Critérios de valiação
1. A DO450 média do controle negativo (cavidades A1 e B1) deve
ser >1.000.
2. A porcentagem de inibição do controle positivo fraco deve ser >50%.
3. A porcentagem de inibição do controle positivo deve ser >80%.
4. A falta de concordância nestes critérios é razão para desprezar os
resultados da respectiva placa de teste.
Observação:
• Se a DO450 da amostra teste é maior que a DO450 máx, a porcentagem de
inibição pode ser interpretada como 0%.
• Se a DO450 média do controle negativo estiver abaixo de 1.000
possivelmente a solução substrato cromogênio (TMB) está muito fria.
Neste caso pré-aqueçer a solução a 22±3°C ou incube-la por 30 minutos.
• Se a DO450 média do controle negativo estiver acima de 2.000 é
recomendado um curto período de incubação com a solução substrato
cromogênio (TMB).
Interpretação da porcentagem de inibição
PI = <40% Negativo
Anticorpos específicos para PSC estão ausentes na
amostra teste.
PI = ≥40% Positivo
Anticorpos específicos para PSC estão presentes na
amostra teste.
Bibliografía
1. Holm JM (1981) Acta Vet Scand 22:85-98.
2. Wensvoort G, Bloemraad M, Terpstra C (1988) Vet Microb 17:129-140.
3. Wensvoort G (1989) J Gen Virol 70:2865-2876.
4. Wensvoort G, Boonstra J, Bodzinga BG (1990) J Gen Virol 71:531-540.
5. Colijn E, Bloemraad M, Wensvoort G (1997) Vet Microbiol 59:15-25.
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Rev.
Data
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A.0 21 junho 2019
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