Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV NS Ab Strip Kit Guia de usuario
- Tipo
- Guia de usuario
Somente para uso veterinario. Somente para uso in vitro.
INSTRUÇÕES DE USO
PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit
ELISA para detecção de anticorpos contra a proteína não-estrutural do vírus da Febre Aftosa em soro de bovideos, ovinos, caprinos e suínos
Nº de
produto 7630130 N.º de pub. MAN0018657 Rev.
A.0
PRODUTO IMPORTADO
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Leia as Ficha de Informações de Segurança (FISPQ) e siga as instruções de manuseio. Use trajes, óculos e luvas de proteção
adequados. Ficha de Informações de Segurança (FISPQ) estão disponíveis em thermofisher.com/support.
ATENÇÃO! RISCO BIOLÓGICO POTENCIAL.
Leia as informações de segurança sobre risco biológico na página do produto em thermofisher.com.
Use trajes, óculos e luvas de proteção adequados.
Introdução
A Febre Aftosa é a mais importante ameaça econômica para animais de produção industrial. A doença altamente contagiosa afeta todos os animais de
cascos fendidos e é amplamente difundida pelo mundo. Os vírus da Febre Aftosa são classificados em 7 distintos sorotipos que são diagnosticados por
complexos métodos sorológicos convencionais. Em alguns países a doença é controlada por vacinação preventiva. No entanto, na maioria dos países livres
da doença, a vacinação é banida. Na União Européia a vacinação contra Febre Aftosa está banida desde 1991 e os surtos são controlados por morte dos
animais infectados e morte preventiva. Para controlar surtos vacinação de emergência no futuro deverá ser realizada. As vacinas consistem de (partes)
proteínas estruturais purificadas do vírus da Febre Aftosa e conseqüentemente os animais vacinados exibem anticorpos diretos contra a proteína estrutural
do vírus. Entretanto, após infecção com vírus da Febre Aftosa, anticorpos diretos contra proteínas estruturais e não-estruturais são produzidos.
Conseqüentemente um ELISA para detectar anticorpos contra proteínas não-estruturais do vírus da Febre Aftosa detecta não somente animais infectados
mas também discrimina entre animais infectados e vacinados.
O ELISA FMDV-NS foi desenvolvido e descrito por K.J. Sorensen et al 1998 (Arch. Virol. 143: 1461-1476). Baseados nestes reagentes foi feito um kit de teste
de ELISA pronto para uso. Desde então o Applied Biosystems™ PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit foi avaliado mundialmente por vários laboratórios de
referência para Febre Aftosa.
O kit de teste contém todos os ingredientes necessários para realizar o teste. Com o kit PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit 5 × 90 amostras podem ser testadas.
Para um teste rápido de um pequeno número de amostras o PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit está disponível também em uma versão com 2 placas de 2 tiras.
Aplicação do PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit
O kit PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit detecta anticorpos contra a proteína não-estrutural 3ABC do vírus da Febre Aftosa. O ELISA detecta animais
infectados com o vírus da Febre Aftosa independente do sorotipo que causa a infecção e independente do fato do animal ser vacinado ou não. O ELISA
pode ser usado para testar amostras de soros de bovideos, ovinos, caprinos e suínos.
Principio del ensayo
O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit é um ELISA de bloqueio. As placas de ELISA foram revestidas com monoclonal específico 3ABC seguida por
incubação com a proteína 3ABC. Conseqüentemente, as placas de teste do kit contém antígeno FMDV-NS capturado pelo MAb revestido.
O teste é realizado dispensando-se as amostras testes nas cavidades da placa. Após incubação a placa é lavada e o conjugado é adicionado. Anticorpos
FMDV-NS específicos, direcionados contra proteínas não-estruturais, que podem estar presentes na amostra teste se ligará à proteína 3ABC e bloqueará a
ligação do MAb-HRPO. Após incubação, a placa é lavada e o cromogênio/substrato pronto para uso é adicionado.
Se a ligação do conjugado MAb é bloqueada por anticorpos específicos na amostra teste, o conjugado não-ligado será lavado para fora e será desenvolvida
menor coloração ou não coloração, indicando a presença de anticorpos FMDV-NS específicos na placa de teste.
Se o conjugado se ligou ao antígeno ocorrerá desenvolvimento de coloração, indicando que anticorpos FMDV-NS específicos estão ausentes na placa de teste.
O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit é um teste de diluição simples. A diluição do soro varia de acordo com o protocolo selecionado.
• Protocolo noturno de incubação do soro: As amostras de soros são testadas em uma diluição 1:5.
• Protocolo de um dia de incubação do soro: As amostras de soros são testadas em uma diluição 1:2.6.
O teste contém três controles prontos para uso. O controle positivo é uma amostra positiva forte para FMDV-NS e sempre mostra score positivo alto no
teste (Porcentagem de Inibição >70%). O controle positivo fraco poderá apresentar uma Porcentagem de Inibição >50%. O controle negativo determina a
DO450 máxima do teste.
Componentes do kit
Kit de 5 placas para maximal 450 amostras (no máximo 30 series independentes
de testes). O kit deve ser armazenado a 5±3°C até a data de sua validade. Vide o
rótulo para data de validade. O prazo de validade dos componentes diluído,
aberto ou reconstituído está descrito abaixo, quando apropriado.
Componente
Descrição
1: Placas de teste
Cinco placas de teste embalados a vácuo com um
sachê desumidificante.
2: Conjugado
Concentrado 30x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 2.2 mL de conjugado. Após diluído não é
estável, preparar somente no momento de uso.
3: Tampão de diluição
Concentrado 2x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 60 mL de tampão de diluição. Prazo de
validade dessa solução de 24 horas a 5±3°C.
4: Additivo
Liofilizado. Cinco frascos contendo 2.5 mL de aditivos
liofilizado. O aditivo reconstituído pode ser
armazenado a −20°C até a data de validade.
5: Água desmineralizada
Dios frascos contendo 10 mL de água
desmineralizada.
6: Fluido de lavagem
Concentrado 200x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 60 mL de fluido de lavagem. Prazo de
validade da solução de lavagem:
1 semana a temperatura ambiente (22±3°C).
7: Controle positivo
Pronto para uso. Um frasco contendo 1.4 mL de
controle positivo.
8: Controle positivo fraco
Pronto para uso. Um frasco contendo 1.4 mL de
controle positivo fraco.
9: Controle negativo
Pronto para uso. Um frasco contendo 1.4 mL de
controle negativo.
10: Substrato Cromogênio
(TMB)
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
solução Substrato Cromogênio (TMB).
Componente
Descrição
11: Solução bloqueadora
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
solução bloqueadora.
Adicionais
• 1 tapa placa para cubrir as tiras durante a incubação
• 1 Bolsa de aluminio
Materiais adicionais necessários não fornecidos
A menos que haja orientações diferentes, todos os materiais estão
disponíveis em thermofisher.com.
Água dionizada
Reservatório para solução
Pipeta monocanal (5–50 µL)
Vórtex
Pipeta monocanal (20–200 µL)
Tubos
Pipeta monocanal (100–1000 µL)
Lavadora de placas (opcional)
Pipeta multicanal (5–50 µL)
Incubadora de microplaca (alcançando no
mínimo 50°C)
Pipeta multicanal (50–300 µL)
Leitor de placas. O leitor deve possuir um
filtro apropriado para leitura de placas a
450 nm
Ponteiras para pipetas (como
recmendado pelo fabricante da pipeta).
2 PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit Instruções de uso
Procedimento para o teste
Precauções
As regulamentações nacionais de segurança devem ser rigorosamente
seguidas. O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit deve ser usado em
laboratórios apropriados para este tipo de teste.
Para obter resultados ótimos com o PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit,
deve-se considerar o seguinte:
• O protocolo de procedimento de teste deve ser estritamente seguido.
• Todos os reagentes do kit devem estar a temperatura ambiente
(22±3°C) antes do uso.
• A solução bloqueadora é fortemente ácida. Evitar contato com pele e
olhos.
• As ponteiras das pipetas devem ser trocados a cada etapa de
pipetagem.
• Utilizar recipientes separados para cada reagente.
• Os componentes do kit não devem ser usados após a data de
validade ou se forem observadas alterações em sua aparência.
• Componentes de diferentes partidas de kits não devem ser misturadas.
• Deve ser usado para o teste água desmineralizada ou de qualidade
semelhante.
Soluções de preparo prévio
Tampão de diluição
Diluir o tampão de diluição concentrado (Componente 3) a 1:1 em água
deionizada. Preparar 4 mL por duas tiras (2 mL de tampão concentrado e
2 mL de água deionizada).
Pode ser conservado refrigerado (5±3°C) até 24 horas.
Aditivo
Equilibrar o frasco de aditivo liofilizado (Componente 4) à temperatura
ambiente e reconstituir o frasco com água desmineralizada fornecida com o
kit (veja o rótulo do frasco para o volume a ser adicionado). Quando não
estiver em uso, armazenar a −20°C até a data de validade.
Tampão ELISA
Adicionar aditivo reconstituído ao tampão de diluição até uma
concentração final de 10% (v/v). Preparar 4 mL por duas tiras (0.4 mL de
aditivo e 3.6 mL de tampão de diluição). Armazenar o tampão ELISA não
usado entre 5±3°C até 24 horas.
Conjugado
Prepare a diluição fresca de trabalho do conjugado (Componente 2)
(especificada no rótulo do frasco) no tampão ELISA. Ex.: para duas tiras
prepare 2.1 mL (2.03 mL de Tampão de ELISA + 70 µL de Conjugado 30x).
Obs.: O conjugado diluído deve ser preparado imediatamente antes do uso.
Solução de lavagem
O fluido de lavagem (200x) (Componente 4) deve ser diluíso a 1:200 em
água desmineralizada e é suficiente para um volume final de 12 litros de
solução de lavagem.
Estabilidade da solução de lavagem: 1 semana armazenada a 22±3°C.
Obs.: Deve ser usado lavadoras de ELISA comercialmente disponíveis. Se não
for possível, a lavagem da placa pode ser feita dispensando-se 200–300 µL de
solução de lavagem em todas as cavidades da placa. Em seguida, esvaziar e
repetir quantas vezes como prescrito. Não é necessário encharcar a placa entre
as lavagens. Bater a placa firmemente após a última lavagem.
Incubação com soro teste
Realize a incubação do soro usando o protocolo noturno ou de um dia. Os
volumes necessários das amostras de teste e de controle diferem consoante
o protocolo selecionado.
Protocolo noturno de incubação do soro
1. Adicione 80 µL de tampão ELISA em todas as cavidades (Componente 1)
2. Adicione 20 µL de controle negativo (Componente 9) nas cavidades
A1 e B1.
3. Adicione 20 µL do controle positivo fraco (Componente 8) nas cavidades
C1 e D1.
4. Adicione 20 µL do controle positivo (Componente 7) nas cavidades E1 e F1.
5. Adicione 20 µL da amostra teste no restante das cavidades.
6. Vede as placas de teste com as tampas.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube as placas (16–18 horas) à temperatura ambiente (22±3°C).
Protocolo de um dia de incubação do soro
1. Adicione 80 µL de tampão ELISA em todas as cavidades
(Componente 1)
2. Adicione 50 µL de controle negativo (Componente 9) nas cavidades
A1 e B1.
3. Adicione 50 µL do controle positivo fraco (Componente 8) nas
cavidades C1 e D1.
4. Adicione 50 µL do controle positivo (Componente 7) nas cavidades
E1 e F1.
5. Adicione 50 µL da amostra teste no restante das cavidades.
6. Vede as placas de teste com as tampas.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube durante duas horas a 22±3°C.
Incubação com conjugado
Observação: Se for usado o protocolo noturno de incubação do soro, este
procedimento será realizado no segundo dia.
1. Esvazie a Placa de teste após o período de incubação do soro. Em
seguida, lave a placa seis vezes com 200 a 300 µL de solução de
lavagem. Bater as placas firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de diluição de trabalho do conjugado em todas as
cavidades.
3. Vede as placas de teste com as tampas.
4. Incube as placas por 60±5 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
Incubação com solução Substrato Cromogênio (TMB)
1. Esvaziar a placa de teste após o período de incubação e lavar a placa
6 vezes com 200–300 µL de solução de lavagem. Bater as placas
firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de solução Substrato Cromogênio (TMB)
(Componente 10) em todas as cavidades.
3. Incube as placas por 20 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
4. Adicione 100 µL de solução bloqueadora (Componente 11) em todas as
cavidades.
5. Misture o conteúdo de todas as cavidades das placas antes da leitura.
Observação: Inicie a adição da solução bloqueadora 20 minutos após a
primeira cavidade ter sido preenchida com solução substrato cromogênio
(TMB). Adicione a solução bloqueadora na mesma ordem e no mesmo
ritmo que a solução cromogênio/substrato foi adicionada.
Leitura da(s) placa(s) e cálculo dos resultados
1. Medir a densidade óptica (DO) de todas ascavidades a 450 nm
preferencialmente em 15 minutos após o desenvolvimento da coloração
ter cessado.
2. Calcule o valor médio DO450 das cavidades A1 e B1
(controle negativo = DO450 máx).
3. A porcentagem de inibição (PI) dos controles e do soro teste é calculada
de acordo com a fórmula:
Observação: Os valores de DO450 de todas as amostras são expressas como
porcentagem de inibição (PI) relativa à DO450 máximo (DO450 máx).
PI = 100 − (DO450 amostra / DO450 máx) × 100
Interpretación de los resultados
Critérios para avaliação
1. A DO450 média do controle negativo (cavidades A1 e B1 = DO450 máx)
deve ser >1.000.
2. A porcentagem de inibição média do controle positivo fraco deve ser >50%.
3. A porcentagem de inibição média do controle positivo deve ser >70%.
4. Não encontrando algum destes critérios é razão para descartar os
resultados da respectiva placa de teste.
Observação: Se a DO450 da amostra teste é maior que a DO450 máx, a
porcentagem de inibição pode ser interpretada como 0%. Se a DO450 média
do controle negativo estiver abaixo de 1.000 possivelmente a solução
substrato cromogênio (TMB) está muito fria. Neste caso pré-aqueça a
solução para 22±3°C ou incube por até 30 minutos. Se a DO450 média do
controle negativo estiver acima de 2.000 é recomendado um curto período
de incubação com a solução substrato cromogênio (TMB).
Interpretação da porcentagem de inibição
PI = <50%
Negativo
Sem anticorpos contra a proteína NS para Febre Aftosa.
PI = ≥50%
Positivo
Com anticorpos contra a proteína NS para Febre Aftosa.
Anexo A - Bibliografía
Sørensen KJ, Madsen KG, Madsen ES, Salt JS, Nqindi J, Mackay DKJ (1998)
Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by
the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and
3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol
143:1461−1476.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
9 setembro 2019
Suporte técnico e atendimento ao cliente
Suporte técnico: visite thermofisher.com/askaquestion
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serviços e suporte, incluindo:
• Telefones de contato do mundo inteiro
• Pedido e suporte on-line
• Guias do usuário, manuais e protocolos
• Certificados de análise
• Fichas de segurança (SDSs; também conhecida como MSDSs)
NOTA: Para obter SDSs de reagentes e produtos químicos de outros
fabricantes, entre em contato com o fabricante.
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Em caso de dúvidas, entre em contato com a Life Technologies em
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Histórico de revisão: Da publicação nº MAN0018657 (Português)
Rev.
Data
Descrição
A.0 9 setembro
2019
• Documento novo. O documento inicial (PrioCHECK_FMDV-
NS_7630130 (5 strip)_v1 0_Port 130912.docx) foi convertido para o
modelo de documento atual, com as atualizações necessárias
referentes ao número da publicação, às informações sobre licença
limitada, à garantia, às marcas registradas e ao logotipo.
• Adição do protocolo de um dia de incubação do soro.
• O nome do produto foi alterado de PrioCHECK® FMDV NS para
PrioCHECK
™
FMDV NS Ab Strip Kit.
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