2 PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit Instruções de uso
Soluções de preparo prévio
Tampão de diluição
Diluir o tampão de diluição concentrado (Componente 3) a 1:1 em água
deionizada. Preparar 24 mL por placa de teste (12 mL de tampão
concentrado e 12 mL de água deionizada). Pode ser conservado refrigerado
(5±3°C) ate 24 hs.
Aditivo
Equilibrar o frasco de aditivo liofilizado (Componente 4) à temperatura
ambiente e reconstituir o frasco com água desmineralizada fornecida com o
kit (veja o rótulo do frasco para o volume a ser adicionado). Quando não
estiver em uso, armazenar a −20°C ate a data de validade.
Reconstitution of the lyophilized Additive should be performed as follows:
1. Equilibrate the vial to 22±3°C.
2. With the vial in an upright position, tap the vial gently against the
worktop to ensure that the content is on the bottom of the vial.
3. Carefully open the vial.
4. Add the specified amount of Demineralized Water (Component 5).
5. Replace the stopper on the vial and allow the lyophilized material to
dissolve.
6. Gently agitate the vial so that any remaining dry material will be
dissolved.
7. Allow the material to stand at least for 15 minutes at 22±3°C before use.
8. Mix gently and intermittently (formation of foam should be avoided).
Tampão ELISA
Adicionar aditivo reconstituído ao tampão de diluição até uma
concentração final de 10% (v/v). Preparar 24 mL por placa de teste (2.4 mL
de aditivo e 21.6 mL de tampão de diluição). Armazenar o tampão ELISA
não usado entre 5±3°C ate 24 hs.
Conjugado
Prepare a diluição fresca de trabalho do conjugado (Componente 2)
(especificada no rótulo do frasco) no tampão ELISA. Ex.: para uma placa
prepare 12 mL (11.6 mL de Tampão de ELISA + 400 µL de conjugado 30x).
Obs.: O conjugado diluído deve ser preparado imediatamente antes do uso.
Solução de lavagem
O fluido de lavagem (200x) (Componente 4) deve ser diluíso a 1:200 em
água desmineralizada e é suficiente para um volume final de 12 litros de
solução de lavagem.
Estabilidade da solução de lavagem: 1 semana armazenada a 22±3°C.
Obs.: Deve ser usado lavadoras de ELISA comercialmente disponíveis. Se não
for possível, a lavagem da placa pode ser feita dispensando-se 200−300 µL de
solução de lavagem em todas as cavidades da placa. Em seguida, esvaziar e
repetir quantas vezes como prescrito. Não é necessário encharcar a placa entre
as lavagens. Bater a placa firmemente após a última lavagem.
Incubação com soro teste
Realize a incubação do soro usando o protocolo noturno ou de um dia. Os
volumes necessários das amostras de teste e de controle diferem consoante
o protocolo selecionado.
Protocolo noturno de incubação do soro
1. Adicione 80 µL de tampão ELISA em todas as cavidades
(Componente 1)
2. Adicione 20 µL de controle negativo (Componente 9) nas cavidades
A1 e B1.
3. Adicione 20 µL do controle positivo fraco (Componente 8) nas
cavidades C1 e D1.
4. Adicione 20 µL do controle positivo (Componente 7) nas cavidades
E1 e F1.
5. Adicione 20 µL da amostra teste no restante das cavidades.
6. Vede as placas de teste com os adesivos.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube as placas (16–18 horas) à temperatura ambiente (22±3°C).
Protocolo de um dia de incubação do soro
1. Adicione 80 µL de tampão ELISA em todas as cavidades
(Componente 1)
2. Adicione 50 µL de controle negativo (Componente 9) nas cavidades
A1 e B1.
3. Adicione 50 µL do controle positivo fraco (Componente 8) nas
cavidades C1 e D1.
4. Adicione 50 µL do controle positivo (Componente 7) nas cavidades
E1 e F1.
5. Adicione 50 µL da amostra teste no restante das cavidades.
6. Vede as placas de teste com os adesivos.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube durante duas horas a 22±3°C.
Incubação com conjugado
Observação: Se for usado o protocolo noturno de incubação do soro, este
procedimento será realizado no segundo dia.
1. Esvazie a Placa de teste após o período de incubação do soro. Em
seguida, lave a placa seis vezes com 200 a 300 µL de solução de
lavagem. Bater as placas firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de diluição de trabalho do conjugado em todas as
cavidades.
3. Vede as placas de teste com os adesivos.
4. Incube as placas por 60±5 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
Incubação com solução substrato cromogênio (TMB)
1. Esvaziar a placa de teste após o período de incubação e lavar a placa
6 vezes com 200–300 µL de solução de lavagem. Bater as placas
firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de solução substrato cromogênio (TMB)
(Componente 10) em todas as cavidades.
3. Incube as placas por 20 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
4. Adicione 100 µL de solução bloqueadora (Componente 11) em todas as
cavidades.
5. Misture o conteúdo de todas as cavidades das placas antes da leitura.
Observação: Inicie a adição da solução bloqueadora 20 minutos após a
primeira cavidade ter sido preenchida com solução substrato cromogênio
(TMB). Adicione a solução bloqueadora na mesma ordem e no mesmo
ritmo que a solução cromogênio/substrato foi adicionada.
Leitura da(s) placa(s) e cálculo dos resultados
1. Medir a densidade óptica (DO) de todas ascavidades a 450 nm
preferencialmente em 15 minutos após o desenvolvimento da coloração
ter cessado.
2. Calcule o valor médio DO450 das cavidades A1 e B1
(controle negativo = DO máx).
3. A porcentagem de inibição (PI) dos controles e do soro teste é calculada
de acordo com a fórmula:
PI = 100 − (DO450 amostra / DO450 máx) × 100
Observação: Os valores de DO450 de todas as amostras são expressas como
porcentagem de inibição (PI) relativa à DO450 máximo (DO450 máx).
Interpretación de los resultados
Critérios para avaliação
1. A DO450 média do controle negativo (cavidades A1 e B1 = DO máx) deve
ser >1.000.
2. A porcentagem de inibição média do controle positivo fraco deve
ser >50%.
3. A porcentagem de inibição média do controle positivo deve ser >70%.
4. Não encontrando algum destes critérios é razão para descartar os
resultados da respectiva placa de teste.
Observação: Se a DO450 da amostra teste é maior que a DO450 máx, a
porcentagem de inibição pode ser interpretada como 0%. Se a DO450 média
do controle negativo estiver abaixo de 1.000 possivelmente a solução
substrato cromogênio (TMB) está muito fria. Neste caso pré-aqueça a
solução para 22±3°C ou incube por até 30 minutos. Se a DO450 média do
controle negativo estiver acima de 2.000 é recomendado um curto período
de incubação com a solução substrato cromogênio (TMB).
Interpretação da porcentagem de inibição
Sem anticorpos contra a proteína NS para Febre Aftosa.
Com anticorpos contra a proteína NS para Febre Aftosa.
Bibliografía
Sørensen KJ, Madsen KG, Madsen ES, Salt JS, Nqindi J, Mackay DKJ (1998)
Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by
the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and
3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol
143:1461−1476.