Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV NS Ab Plate Kit Guia de usuario

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
PrioCHECK FMDV NS Ab Plate Kit
Tipo
Guia de usuario
Somente para uso veterinário. Somente para uso in vitro.
INSTRUÇÕES DE USO
PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit
ELISA para detecção de anticorpos contra a proteína não-estrutural do vírus da Febre Aftosa em soro de bovinos, ovinos,
caprinos e suínos
Nº de produto 7630120
N.º de pub. MAN0016802 Rev. A.0
PRODUTO IMPORTADO
ATENÇÃO! Leia as Ficha de Informações de Segurança (FISPQ) e siga as instruções de manuseio. Use trajes, óculos e luvas de proteção
adequados. Ficha de Informações de Segurança (FISPQ) estão disponíveis em thermofisher.com/support.
ATENÇÃO! RISCO BIOLÓGICO POTENCIAL. Leia as informações de segurança sobre risco biológico na página do produto em thermofisher.com.
Use trajes, óculos e luvas de proteção adequados.
Introdução
A Febre Aftosa é a mais importante ameaça econômica para animais de produção industrial. A doença altamente contagiosa afeta todos os animais de
cascos fendidos e é amplamente difundida pelo mundo. Os vírus da Febre Aftosa são classificados em 7 distintos sorotipos que são diagnosticados por
complexos métodos sorológicos convencionais. Em alguns países a doença é controlada por vacinação preventiva. No entanto, na maioria dos países livres
da doença, a vacinação é banida. Na União Européia a vacinação contra Febre Aftosa está banida desde 1991 e os surtos são controlados por morte dos
animais infectados e morte preventiva. Para controlar surtos vacinação de emergência no futuro deverá ser realizada. As vacinas consistem de (partes)
proteínas estruturais purificadas do vírus da Febre Aftosa e conseqüentemente os animais vacinados exibem anticorpos diretos contra a proteína estrutural
do vírus. Entretanto, após infecção com vírus da Febre Aftosa, anticorpos diretos contra proteínas estruturais e não-estruturais são produzidos.
Conseqüentemente um ELISA para detectar anticorpos contra proteínas não-estruturais do vírus da Febre Aftosa detecta não somente animais infectados
mas também discrimina entre animais infectados e vacinados.
O ELISA FMDV-NS foi desenvolvido e descrito por K.J Sorensen et al 1998 [1]. Baseados nestes reagentes foi feito um kit de teste de ELISA pronto para uso.
Desde então o Applied Biosystems™ PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit foi avaliado mundialmente por vários laboratórios de referência para Febre Aftosa.
O kit de teste contém todos os ingredientes necessários para realizar o teste. Com PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit 5 × 90 amostras podem ser testadas. Para
um teste rápido de um pequeno número de amostras o PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit está disponível também em uma versão com 2 placas de 2 tiras.
Aplicação do PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit
O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit detecta anticorpos contra a proteína não-estrutural 3ABC do vírus da Febre Aftosa. O ELISA detecta animais
infectados com o vírus da Febre Aftosa independente do sorotipo que causa a infecção e independente do fato do animal ser vacinado ou não. O ELISA
pode ser usado para testar amostras de soros de bovinos, ovinos, caprinos e suínos.
Principio del ensayo
O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit é um ELISA de bloqueio. As placas de ELISA foram revestidas com monoclonal específico 3ABC seguida por
incubação com a proteína 3ABC. Conseqüentemente, as placas de teste do kit contém antígeno FMDV-NS capturado pelo MAb revestido.
O teste é realizado dispensando-se as amostras testes nas cavidades da placa. Após incubação a placa é lavada e o conjugado é adicionado. Anticorpos
FMDV-NS específicos, direcionados contra proteínas não-estruturais, que podem estar presentes na amostra teste se ligará à proteína 3ABC e bloqueará a
ligação do MAb-HRPO. Após incubação, a placa é lavada e o cromogênio/substrato pronto para uso é adicionado.
Se a ligação do conjugado MAb é bloqueada por anticorpos específicos na amostra teste, o conjugado não-ligado será lavado para fora e será desenvolvida
menor coloração ou não coloração, indicando a presença de anticorpos FMDV-NS específicos na placa de teste. Se o conjugado se ligou ao antígeno ocorrerá
desenvolvimento de coloração, indicando que anticorpos FMDV-NS específicos estão ausentes na placa de teste.
O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit é um teste de diluição simples. A diluição do soro varia de acordo com o protocolo selecionado.
• Protocolo noturno de incubação do soro: As amostras de soros são testadas em uma diluição 1:5.
• Protocolo de um dia de incubação do soro: As amostras de soros são testadas em uma diluição 1:2.6.
O teste contém três controles prontos para uso. O controle positivo é uma amostra positiva forte para FMDV-NS e sempre mostra score positivo alto no teste
(Porcentagem de Inibição >70%). O controle positivo fraco poderá apresentar uma Porcentagem de Inibição >50%. O controle negativo determina a DO450
máxima do teste.
Componentes do kit
Kit de 5 placas para 450 amostras. Vide o rótulo para data de validade. O
prazo de validade dos componentes diluído, aberto ou reconstituído está
descrito abaixo, quando apropriado.
Componente
Descrição
1: Placas de teste
Cinco placas de teste embalados a vácuo com um
sachê desumidificante.
2: Conjugado
Concentrado 30x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 2.5 mL de conjugado. Após diluído não é
estável, preparar somente no momento de uso.
3: Tampão de diluição
Concentrado 2x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 60 mL de tampão de diluição. Prazo de
validade dessa solução de 24 horas a 5±3°C.
4: Additivo
Liofilizado. Cinco frascos contendo 2.5 mL de aditivos
liofilizado. O aditivo reconstituído pode ser
armazenado a −20°C até a data de validade.
5: Água desmineralizada
Dios frascos contendo 10 mL de água
desmineralizada.
6: Fluido de lavagem
Concentrado 200x, diluir antes de usar. Um frasco
contendo 60 mL de fluido de lavagem. Prazo de
validade da solução de lavagem:
1 semana a temperatura ambiente (22±3°C).
7: Controle positivo
Pronto para uso. Um frasco contendo 0.6 mL de
controle positivo.
8: Controle positivo fraco
Pronto para uso. Um frasco contendo 0.6 mL de
controle positivo fraco.
9: Controle negativo
Pronto para uso. Um frasco contendo 0.6 mL de
controle negativo.
10: Substrato Cromogênio
(TMB)
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
solução substrato cromogênio (TMB).
11: Solução bloqueadora
Pronto para uso. Um frasco contendo 60 mL de
solução bloqueadora.
Adicionais
10 adesivos para selar as placas
São necessários materiais adicionais
A menos que haja orientações diferentes, todos os materiais estão
disponíveis em thermofisher.com.
• Água dionizada
• Reservatório para solução
• Pipeta monocanal (5–50 µL)
• Vórtex
• Pipeta monocanal (20–200 µL)
• Tubos
• Pipeta monocanal (100–1000 µL)
• Incubadora de microplaca (alcançando
no mínimo 50°C)
• Pipeta multicanal (5–50 µL)
• Lavadora de placas
• Pipeta multicanal (50–300 µL)
• Leitor de placas (o leitor deve possuir
um filtro apropriado para leitura de
placas a 450 nm)
• Ponteiras para pipetas (como
recomendado pelo fabricante da pipeta)
Procedimento para o teste
Precauções
As regulamentações nacionais de segurança devem ser rigorosamente
seguidas. O PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit deve ser usado em
laboratórios apropriados para este tipo de teste.
Para obter resultados ótimos com o PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit,
deve-se considerar o seguinte:
• O protocolo de procedimento de teste deve ser estritamente seguido.
• Todos os reagentes do kit devem estar a temperatura ambiente
(22±3°C) antes do uso.
• A solução bloqueadora é fortemente ácida. Evitar contato com pele e olhos.
• As ponteiras das pipetas devem ser trocados a cada etapa de
pipetagem.
• Utilizar recipientes separados para cada reagente.
• Os componentes do kit não devem ser usados após a data de validade
ou se forem observadas alterações em sua aparência.
• Componentes de diferentes partidas de kits não devem ser misturadas.
• Deve ser usado para o teste água desmineralizada ou de qualidade
semelhante.
2 PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit Instruções de uso
Soluções de preparo prévio
Tampão de diluição
Diluir o tampão de diluição concentrado (Componente 3) a 1:1 em água
deionizada. Preparar 24 mL por placa de teste (12 mL de tampão
concentrado e 12 mL de água deionizada). Pode ser conservado refrigerado
(5±3°C) ate 24 hs.
Aditivo
Equilibrar o frasco de aditivo liofilizado (Componente 4) à temperatura
ambiente e reconstituir o frasco com água desmineralizada fornecida com o
kit (veja o rótulo do frasco para o volume a ser adicionado). Quando não
estiver em uso, armazenar a −20°C ate a data de validade.
Reconstitution of the lyophilized Additive should be performed as follows:
1. Equilibrate the vial to 22±3°C.
2. With the vial in an upright position, tap the vial gently against the
worktop to ensure that the content is on the bottom of the vial.
3. Carefully open the vial.
4. Add the specified amount of Demineralized Water (Component 5).
5. Replace the stopper on the vial and allow the lyophilized material to
dissolve.
6. Gently agitate the vial so that any remaining dry material will be
dissolved.
7. Allow the material to stand at least for 15 minutes at 22±3°C before use.
8. Mix gently and intermittently (formation of foam should be avoided).
Tampão ELISA
Adicionar aditivo reconstituído ao tampão de diluição até uma
concentração final de 10% (v/v). Preparar 24 mL por placa de teste (2.4 mL
de aditivo e 21.6 mL de tampão de diluição). Armazenar o tampão ELISA
não usado entre 5±3°C ate 24 hs.
Conjugado
Prepare a diluição fresca de trabalho do conjugado (Componente 2)
(especificada no rótulo do frasco) no tampão ELISA. Ex.: para uma placa
prepare 12 mL (11.6 mL de Tampão de ELISA + 400 µL de conjugado 30x).
Obs.: O conjugado diluído deve ser preparado imediatamente antes do uso.
Solução de lavagem
O fluido de lavagem (200x) (Componente 4) deve ser diluíso a 1:200 em
água desmineralizada e é suficiente para um volume final de 12 litros de
solução de lavagem.
Estabilidade da solução de lavagem: 1 semana armazenada a 22±3°C.
Obs.: Deve ser usado lavadoras de ELISA comercialmente disponíveis. Se não
for possível, a lavagem da placa pode ser feita dispensando-se 200−300 µL de
solução de lavagem em todas as cavidades da placa. Em seguida, esvaziar e
repetir quantas vezes como prescrito. Não é necessário encharcar a placa entre
as lavagens. Bater a placa firmemente após a última lavagem.
Incubação com soro teste
Realize a incubação do soro usando o protocolo noturno ou de um dia. Os
volumes necessários das amostras de teste e de controle diferem consoante
o protocolo selecionado.
Protocolo noturno de incubação do soro
1. Adicione 80 µL de tampão ELISA em todas as cavidades
(Componente 1)
2. Adicione 20 µL de controle negativo (Componente 9) nas cavidades
A1 e B1.
3. Adicione 20 µL do controle positivo fraco (Componente 8) nas
cavidades C1 e D1.
4. Adicione 20 µL do controle positivo (Componente 7) nas cavidades
E1 e F1.
5. Adicione 20 µL da amostra teste no restante das cavidades.
6. Vede as placas de teste com os adesivos.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube as placas (16–18 horas) à temperatura ambiente (22±3°C).
Protocolo de um dia de incubação do soro
1. Adicione 80 µL de tampão ELISA em todas as cavidades
(Componente 1)
2. Adicione 50 µL de controle negativo (Componente 9) nas cavidades
A1 e B1.
3. Adicione 50 µL do controle positivo fraco (Componente 8) nas
cavidades C1 e D1.
4. Adicione 50 µL do controle positivo (Componente 7) nas cavidades
E1 e F1.
5. Adicione 50 µL da amostra teste no restante das cavidades.
6. Vede as placas de teste com os adesivos.
7. Agite suavemente as placas.
8. Incube durante duas horas a 22±3°C.
Incubação com conjugado
Observação: Se for usado o protocolo noturno de incubação do soro, este
procedimento será realizado no segundo dia.
1. Esvazie a Placa de teste após o período de incubação do soro. Em
seguida, lave a placa seis vezes com 200 a 300 µL de solução de
lavagem. Bater as placas firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de diluição de trabalho do conjugado em todas as
cavidades.
3. Vede as placas de teste com os adesivos.
4. Incube as placas por 60±5 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
Incubação com solução substrato cromogênio (TMB)
1. Esvaziar a placa de teste após o período de incubação e lavar a placa
6 vezes com 200–300 µL de solução de lavagem. Bater as placas
firmemente após a última lavagem.
2. Adicione 100 µL de solução substrato cromogênio (TMB)
(Componente 10) em todas as cavidades.
3. Incube as placas por 20 minutos à temperatura ambiente (22±3°C).
4. Adicione 100 µL de solução bloqueadora (Componente 11) em todas as
cavidades.
5. Misture o conteúdo de todas as cavidades das placas antes da leitura.
Observação: Inicie a adição da solução bloqueadora 20 minutos após a
primeira cavidade ter sido preenchida com solução substrato cromogênio
(TMB). Adicione a solução bloqueadora na mesma ordem e no mesmo
ritmo que a solução cromogênio/substrato foi adicionada.
Leitura da(s) placa(s) e cálculo dos resultados
1. Medir a densidade óptica (DO) de todas ascavidades a 450 nm
preferencialmente em 15 minutos após o desenvolvimento da coloração
ter cessado.
2. Calcule o valor médio DO450 das cavidades A1 e B1
(controle negativo = DO máx).
3. A porcentagem de inibição (PI) dos controles e do soro teste é calculada
de acordo com a fórmula:
PI = 100 − (DO450 amostra / DO450 máx) × 100
Observação: Os valores de DO450 de todas as amostras são expressas como
porcentagem de inibição (PI) relativa à DO450 máximo (DO450 máx).
Interpretación de los resultados
Critérios para avaliação
1. A DO450 média do controle negativo (cavidades A1 e B1 = DO máx) deve
ser >1.000.
2. A porcentagem de inibição média do controle positivo fraco deve
ser >50%.
3. A porcentagem de inibição média do controle positivo deve ser >70%.
4. Não encontrando algum destes critérios é razão para descartar os
resultados da respectiva placa de teste.
Observação: Se a DO450 da amostra teste é maior que a DO450 máx, a
porcentagem de inibição pode ser interpretada como 0%. Se a DO450 média
do controle negativo estiver abaixo de 1.000 possivelmente a solução
substrato cromogênio (TMB) está muito fria. Neste caso pré-aqueça a
solução para 22±3°C ou incube por até 30 minutos. Se a DO450 média do
controle negativo estiver acima de 2.000 é recomendado um curto período
de incubação com a solução substrato cromogênio (TMB).
Interpretação da porcentagem de inibição
Negativo
Sem anticorpos contra a proteína NS para Febre Aftosa.
Positivo
Com anticorpos contra a proteína NS para Febre Aftosa.
Bibliografía
Sørensen KJ, Madsen KG, Madsen ES, Salt JS, Nqindi J, Mackay DKJ (1998)
Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by
the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and
3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol
143:1461−1476.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
27 fevereiro 2021
Suporte técnico e atendimento ao cliente
Suporte técnico: visite thermofisher.com/askaquestion
Visite thermofisher.com/support para ver as últimas novidades em termos
serviços e suporte, incluindo:
• Telefones de contato do mundo inteiro
• Pedido e suporte on-line
• Guias do usuário, manuais e protocolos
• Certificados de análise
• Fichas de segurança (SDSs; também conhecida como MSDSs)
NOTA: Para obter SDSs de reagentes e produtos químicos de outros
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Histórico de revisão da publicação nº MAN0016802 (portugues)
Rev.
Data
Descrição
A.0 27 fevereiro
2021
• Documento novo. O documento inicial [PrioCHECK FMDV-NS 7630120
(5 solid) v1.2_Port.DOC] foi convertido para o modelo de documento
atual, com as atualizações necessárias referentes ao número da
publicação, às informações sobre licença limitada, à garantia, às
marcas registradas e ao logotipo.
• Adição do protocolo de um dia de incubação do soro.
• O nome do produto foi alterado de PrioCHECK® FMDV NS para
PrioCHECK
™
FMDV NS Ab Plate Kit.
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